抗衰新發(fā)現(xiàn)：IL4-Stat6途徑可有效延緩衰老
細(xì)胞衰老是一種不可逆的細(xì)胞周期停滯的狀態(tài)，伴隨著細(xì)胞形態(tài)、功能及代謝的改變。細(xì)胞衰老可以由多種內(nèi)外源性因素誘導(dǎo)，如端粒短縮、DNA損傷、表觀遺傳紊亂、線粒體功能失調(diào)等。當(dāng)衰老細(xì)胞的數(shù)量在各個器官和組織的數(shù)量占比增加時，伴隨著衰老相關(guān)分泌表型的產(chǎn)生（SASP），釋放出更多的促炎癥細(xì)胞因子，產(chǎn)生慢性炎癥的同時改變細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的機械特性，使組織變硬并降低微環(huán)境的粘彈性功能，加速機體的衰老。免疫系統(tǒng)有一套特有的機制來監(jiān)測衰老細(xì)胞并執(zhí)行清除行動，但是炎癥微環(huán)境也可導(dǎo)致免疫細(xì)胞衰老。近期，北京大學(xué)的邱義福團隊在《Immunity》期刊發(fā)表了題為“Type2 cytokine signaling in macrophages protects from cellular senescence and organismal aging”的文章，揭示IL4-Stat6途徑可以保護巨噬細(xì)胞免于衰老。
研究人員使用GTEx數(shù)據(jù)庫分析生理衰老過程中的2型細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)。結(jié)果顯示，在衰老過程中，人類血細(xì)胞中IL4R、IL13RA1和Stat6的表達(dá)逐漸降低。和年輕小鼠相比，IL13和Stat6在衰老小鼠的多個組織中表達(dá)減少，p53在衰老小鼠的表達(dá)水平上調(diào)。這提示2型細(xì)胞因子的傳導(dǎo)隨著年齡的增長呈下降趨勢。為了研究其中的作用機制，研究人員使用了敲除的小鼠模型，和相同年齡的野生型小鼠相比，敲除IL4RA（IL4RA-/-）和Stat6-/-小鼠被毛灰白，光澤度下降。Stat6-/-小鼠骨密度降低，肌肉含量下降，運動表現(xiàn)和活力喪失。在Y迷宮實驗中，IL4RA-/-和Stat6-/-小鼠正確選擇率較低，均表現(xiàn)出不同程度的空間識別衰退，壽命也比野生型小鼠更短。以上結(jié)果顯示2型細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的缺乏導(dǎo)致了與身體和認(rèn)知相關(guān)的衰老樣表型。那么，這種衰老加速的具體機制又是什么呢？研究人員對小鼠的腎、肝、肺、肌肉、脾臟等多種組織進行定量研究，發(fā)現(xiàn)IL4RA-/-和Stat6-/-小鼠組織中衰老相關(guān)指標(biāo)（Cdkn2a、Cdkn1a）表達(dá)水平降低，DNA損傷相關(guān)指標(biāo)（p53、gH2AX）顯著上調(diào)。免疫組化分析顯示，IL4RA-/-和Stat6-/-小鼠肝、肺、肌肉組織中的gH2AX染色評分降低，β-半乳糖苷酶（SA-b-gal）活性更強。同時，研究人員在雄性和雌性小鼠上得到了相似的結(jié)果，2型細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的缺乏加速衰老并沒有顯示出性別差異（見圖1）。
圖1 IL-4信號的缺失會損害小鼠的健康和壽命
（圖片來源于《Immunity》雜志）
為了了解哪些細(xì)胞在失去2型細(xì)胞因子信號后會出現(xiàn)衰老，研究人員將小鼠的附睪白色脂肪組織（eWAT）分為兩部分，成熟脂肪細(xì)胞和基質(zhì)血管部分（SVF）,并對其進行PCR定量分析。p16Ink4a和p19Arf僅在SVF中表達(dá)增加，而p21Cip1的表達(dá)在這兩部分都出現(xiàn)上調(diào)。研究人員將SVF包含的細(xì)胞分為三類，分別為免疫細(xì)胞（CD45+），內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+）和其他細(xì)胞，并對各部分細(xì)胞所占的比例進行分析。他們發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，Stat6-/-小鼠的免疫細(xì)胞大幅度增加，然而巨噬細(xì)胞的占比下降了將近50%。Stat6的基因敲除增加了p16Ink4a陽性免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的百分比。研究人員在肺、脾等多個組織的也觀察到類似的結(jié)果，提示不同組織的微環(huán)境并沒有減弱p16Ink4a和p19Arf表達(dá)的上調(diào)，衰老巨噬細(xì)胞在不同組織中加速衰老的機制相同（見圖2）。體外研究顯示，骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）Stat6蛋白磷酸化水平極低，這可能是由于BMDMs自分泌或旁分泌的IL4導(dǎo)致的。巨噬細(xì)胞敲除Stat6基因后的變化如下：1. 衰老標(biāo)志物和SASP指標(biāo)的表達(dá)水平顯著增加；2. Ki-67染色結(jié)果顯示，Stat6-/-巨噬細(xì)胞增殖能力受到極大抑制；3. p53和p16表達(dá)水平大幅增加，層粘連蛋白B1（laminB1）表達(dá)水平下調(diào)；4. SA-b-gal+巨噬細(xì)胞比例增加；5. Stat6-/-巨噬細(xì)胞吞噬能力降低。
圖2 衰老巨噬細(xì)胞在Stat6缺陷小鼠中積聚
（圖片來源于《Immunity》雜志）
為了觀察巨噬細(xì)胞缺失Stat6基因?qū)π∈蟮挠绊懀芯咳藛T通過一系列實驗制備了巨噬細(xì)胞特異性缺失Stat6基因的（Stat6flox/flox）小鼠。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，和全身缺失Stat6基因的小鼠一樣，Stat6flox/flox小鼠運動功能和工作記憶下降，骨密度降低（見圖3）。另外，p16Ink4a、p21Cip1、IL1a、IL6、TNFA、MMP3、MMP13等衰老標(biāo)志物在肝臟中表達(dá)水平較高。當(dāng)研究人員使用氯膦酸脂質(zhì)體特異性耗竭巨噬細(xì)胞時，Stat6特異性敲除誘導(dǎo)的衰老標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)消失。使用雷帕霉素治療后Stat6flox/flox小鼠運動功能恢復(fù)，炎癥因子水平降低，器官衰老的趨勢減輕。以上數(shù)據(jù)證實，Stat6敲除巨噬細(xì)胞促進組織衰老，并對衰老相關(guān)的認(rèn)知和生理功能障礙有促進作用。
圖3巨噬細(xì)胞中Stat6的缺失誘導(dǎo)小鼠衰老
（圖片來源于《Immunity》雜志）
研究人員對Stat6缺失的BMDMs細(xì)胞進行轉(zhuǎn)錄組分析時，發(fā)現(xiàn)455個下調(diào)基因和417個上調(diào)基因。通路富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞周期和DNA修復(fù)途徑下調(diào)，而免疫反應(yīng)和炎癥信號途徑表達(dá)高度上調(diào)。RNA測序數(shù)據(jù)表明，Stat6敲除的BMDMs細(xì)胞中SASP顯著增加。同時研究人員還觀察到一系列DNA修復(fù)基因的表達(dá)下調(diào)，這會導(dǎo)致DNA損傷無法及時修復(fù)而產(chǎn)生累積，進而促進衰老。體內(nèi)實驗時也在eWAT的巨噬細(xì)胞中觀察到這種表達(dá)下調(diào)。由于涉及多種DNA修復(fù)途徑，研究人員重新分析六種主要途徑的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)的基因主要富集在同源重組（Homologous Recombination）和范科尼貧血（Fanconi Anemia）途徑。研究人員對Brca1和Ube2t這兩個基因進行重點關(guān)注。免疫印跡分析顯示，Brca1和Ube2t蛋白的表達(dá)水平在Stat6敲除的BMDMs細(xì)胞上明顯下調(diào)。使用順鉑和依托泊苷等DNA損傷誘導(dǎo)劑進行實驗發(fā)現(xiàn)，敲除Stat6基因的BMDMs細(xì)胞對藥物敏感性增加。DNA片段未經(jīng)修復(fù)釋放到細(xì)胞質(zhì)后，可以激活cGAS-STING途徑，促進細(xì)胞衰老和炎癥反應(yīng)。使用STING激動劑激活cGAS-STING通路，促進巨噬細(xì)胞衰老。添加抑制劑后，Stat6缺失的BMDMs細(xì)胞的衰老特征減弱。這些數(shù)據(jù)表明STAT6缺乏誘導(dǎo)的DNA激活cGAS-STING途徑，促進巨噬細(xì)胞衰老（見圖4）。研究人員在Stat6-/--BMDMs細(xì)胞上誘導(dǎo)Stat6過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上均有所恢復(fù)。Stat6過表達(dá)增強了野生型巨噬細(xì)胞的DNA修復(fù)能力。
圖4 Stat6的缺失損害巨噬細(xì)胞的DNA修復(fù)
（圖片來源于《Immunity》雜志）
接下來，研究人員選取人THP-1巨噬細(xì)胞和U937細(xì)胞進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)人IL4可以誘導(dǎo)BRCA1和UBE2T的表達(dá)上調(diào)，而這種誘導(dǎo)可被Stat6抑制劑終止。為了明確IL4治療是否能夠增強巨噬細(xì)胞中DNA的修復(fù)能力，研究人員使用依托泊苷處理細(xì)胞，添加IL4的巨噬細(xì)胞細(xì)胞DNA修復(fù)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，使得細(xì)胞對依托泊苷所致的DNA損傷抗性增強，同時減少了細(xì)胞核DNA的釋放（見圖5）。動物實驗表明，老年野生型小鼠在使用IL4治療2個月后運動和記憶功能改善，SA-b-gal活性降低、衰老標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)；但I(xiàn)L4并未改善Stat6-/-小鼠的組織和器官衰老。以上數(shù)據(jù)表明IL4對小鼠衰老的改善依賴于Stat6途徑。
圖5 IL4治療保護巨噬細(xì)胞免受DNA損傷
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