谷胱甘肽巰基轉移酶(GSTp)活性檢測
實驗原理:
Glutathione S Transferase Pi (GSTp)谷胱甘肽巰基轉移酶是體內生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一,是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。它能催化機體內有害極性化合物與谷胱甘肽結合,防止DNA損害,還可以由非酶結合方式將體內各種潛在毒性化學藥物從體內排出。GSTp能催化內源性谷胱甘肽與1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)結合形成2,4-二硝基苯-谷胱甘肽復合物,在340nm處有吸收峰。因此,測定產物生成量可反映GSTp的活性。
試劑:
100mM NaH2PO4 緩沖液,pH7.0
200mM L-谷胱甘肽(還原型)
100mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)
實驗步驟:
1.取980μl 緩沖液(100mM NaH2PO4,pH7.0),分別加入10μl 配制好的L-谷胱甘肽(還原型)和10μl的CDNB,混勻后得到底物混合液。
2.取100μl底物混合液在微量比色皿中進行調零。
3.將50μl底物混合液與50μl用緩沖液稀釋后的重組大鼠GSTp混勻。
4.在5min內測量OD340nm值。
結果計算:
GSTp的比酶活以1mg蛋白1min內產生1μmol復合物表示。
GSTp比酶活=
(εmM=9.6mmol/(L·cm),為CDNB與谷胱甘肽復合物在340nm下的摩爾吸光系數(shù))
經檢測,云克隆活性蛋白——大鼠重組GSTp(貨號:APB090Ra01)的比酶活為4.025,即,1mg的APB090Ra01在1min內可生成4.025μmol復合物。