CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，其表達是受到子宮和輸卵管兩 個關鍵生殖組織中雌激素的嚴格調控的。分析表明，在子宮和輸卵管中，CUZD1 在 mRNA 水 平上表現出很強的時間、空間的特異性, 其表達位置僅限于子宮和輸卵管的上皮細胞表面。 核苷酸序列分析表明 CUZD1 全長 cDNA 含有一個由 1821 個核酸編碼的開放閱讀框，該閱讀 框可被翻譯成 607 個氨基酸，包含一個單次跨膜區(qū)域以及一個短的胞內蛋白片段。最近的研 究表明 CUZD1 的抗血清能夠抑制卵巢癌細胞的附著和增殖，此外在懷孕后期的子宮中或（和） 胰蛋白酶激活胰腺腺泡細胞中也可能起到重要作用。

現在市面上商業(yè)化的 CUZD1 的產品非常少，Cloud-Clone Crop.針對這一重要蛋白生產了 一系列可用于科研的蛋白、抗體和檢測試劑盒產品提供給廣大的科研人員。

首先通過抗原表位預測，功能結構域分析，mRNA 二級結構預測，重組蛋白可溶性預測 等多種分析方法，最終確定了用于重組表達的蛋白片段-人 CUZD1 (Pro218~Arg479)。該片段 位于胞外區(qū)，具有較強的抗原性，較易在原核中形成可溶表達。依據 uniport 中 Q86UP6 所對 應的蛋白及核酸序列設計引物如下，引物分別含有一個 EcoRI 的酶切位點和一個 XhoI 的酶切 位點，用于后期重組載體的構建：

[ PRIMER INFORMATION ]

Upstream Primer: CGgaattcCCCTCCACCAACTCTGGC

Downstream Primer: CCGctcgagCTATCTCCCATAGTGTCCAAATAAGG

在基因克隆過程中采用高保真酶進行擴增，獲得一個片段大小約為 800bp 的 cDNA 片段。測序正確后，采用傳統(tǒng)的雙酶切法與大腸桿菌表達載體 pCC-GST 連接，并用于 后期的蛋白表達，測序結果如圖 1 所示。

圖 1 pCC-GST-rh CUZD1 T7 terminator primer 反向測序結果

pCC-GST 是由我公司自主構造的原核重組表達載體，具有兩個 融合蛋白表達標簽，his 標簽和 GST 標簽，該重組載體生產的蛋白不 但可用多種方法純化檢測，同時還可以提高蛋白的可溶性以及免疫原 性。在表達標簽和多克隆位點間具有一個蛋白酶酶切位點，可用于重 組標簽的去除。

經過 IPTG 誘導大腸桿菌進行外源重組蛋白表達后，獲得一個大 小約為 59KDa 的重組蛋白（貨號 RPQ635Hu01），如圖 2 所示。

預測其蛋白序列為圖 3 所示序列。

所獲得的序列經過 ncbi 序列比對后發(fā)現，與人 CUZD1 的相似性為 100%，證明我們獲得 了正確的重組蛋白片段，如下圖 4 所示：

Sequence Alignment Results (NCBI reported):

采用鎳柱純化的方法獲得純化后的重組蛋白 CUZD1 后，制備出小鼠抗人 CUZD1 的單克 隆抗體，并采用親和層析的方法獲得高特異性的純化抗體（貨號 MAQ635Hu21），同時免疫兔子 獲得兔抗人 CUZD1 的多克隆抗體（貨號 PAQ635Hu01）。

對相應抗體的質量進行了一系列檢測，包括 Western blot，IHC 等多種檢測，檢測結果如 下圖（圖 5、6）所示。我們檢測了人胰腺癌細胞株 BXPC-3,如圖中顯示。我們在未懷孕大鼠 的子宮樣本檢測中未獲得信號，進一步驗證了 CUZD1 表達的特異性。

IHC 檢測過程中我們使用了人胰腺癌細胞的石蠟組織切片，檢測結果表現出很強的陽性 信號，主要表達在細胞膜上。以上實驗證明我們獲得了高質量的人 CUZD1 抗體。

Cloud-Clone Corp.利用已獲得的蛋白及抗體研發(fā)出對應的 ELISA 檢測試劑盒（ELISA Kit for CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，SEQ635Hu）。該試劑盒采用雙抗 夾心原理，捕獲抗體采用抗人 CUZD1 單抗，檢測抗體采用 CUZD1 多抗。標準品使用高純度 原核表達的重組蛋白（去除蛋白標簽）。該試劑盒靈敏度及特異性高，適用于人源樣本中 CUZD1 含量的檢測。

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